0518-81263339
吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性检测试剂盒说明书
（钼酸铵比色法）
分光法 50管/24样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
脯氨酸是植物应对逆境胁迫重要的渗透调节物质。高等植物体内脯氨酸存在两条合成途径，分别以谷氨酸(Glu)和鸟氨酸(Orn)为起始底物。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS，Δ¹-pyrroline-5-carboxylate synthetase)是谷氨酸途径合成脯氨酸的限速关键酶，在植物抵御逆境胁迫过程中发挥重要作用。
测定原理：
P5CS 为双功能酶，催化谷氨酸转化为吡咯啉-5-羧酸(P5C)；反应过程伴随无机磷释放。采用钼酸铵比色法测定单位时间内体系生成无机磷的含量，以此表征 P5CS 酶活性。
试剂组成和配制：
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产品名称 |
AC031-50T/24S |
Storage |
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试剂一：液体 |
60mL |
4℃ |
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试剂二：液体 |
6mL |
4℃ |
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试剂三：液体 |
6mL |
4℃避光 |
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试剂四：粉剂 |
1瓶 |
4℃避光 |
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试剂五：粉剂 |
1瓶 |
4℃避光 |
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试剂六：液体 |
10mL |
RT避光 |
|
试剂七：10μmol/mL标准磷贮备液 |
10mL |
4℃ |
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说明书 |
1份 |
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试剂四用时加入10mL蒸馏水，溶解后4℃避光保存一周；
试剂五用时加入10mL蒸馏水，溶解后4℃避光保存一周；
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂七20倍稀释，即取0.1mL试剂七加1.9mL蒸馏水充分混匀。
定磷剂的配制：按ddH2O：试剂四：试剂五：试剂六=2：1：1：1的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
需自备仪器和用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、台式离心机、涡旋仪、可调式移液器、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、实验室计时器、EP管、冰和ddH2O。
样本处理：
1、组织样品：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清(浆)样本等液体：直接检测。若有浑浊离心取上清测定即可。
测定步骤：
1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至660nm，用蒸馏水调零。
2、 样本测定：酶促反应(在EP管中依次加入下列试剂)：
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试剂(μL) |
对照管 |
测定管 |
|
试剂二 |
- |
100 |
|
样本 |
- |
100 |
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混匀，37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)准确水浴10min |
||
|
试剂三 |
100 |
100 |
|
试剂二 |
100 |
- |
|
样本 |
100 |
- |
|
混匀，8000g，25℃离心10min，取上清液 |
||
3、 定磷(在EP管中加入下列试剂)
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试剂(μL) |
空白管 |
标准管 |
对照管 |
测定管 |
|
0.5μmol/mL标准磷应用液 |
- |
100 |
- |
- |
|
上清液 |
- |
- |
100 |
100 |
|
蒸馏水 |
100 |
- |
- |
- |
|
定磷试剂 |
1000 |
1000 |
1000 |
1000 |
|
混匀，室温放置30min，在660nm处，记录吸光值为A空白、A标准、A对照、A测定。ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。空白管与对照管仅需检测1-2次即可。 |
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P5CS活性计算：
1、血清(浆)P5CS活力的计算:
单位定义：每小时每毫升血清(浆)中P5CS 消耗ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
P5CS活力(μmol/h/mL)=C标准管×ΔA测定÷ΔA标准×V总÷V样÷T×F =9 ×ΔA测定÷ΔA标准×F
2、按蛋白浓度计算：
单位定义：每小时每毫克组织蛋白中P5CS消耗ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
P5CS活力(μmol/h /mg prot)=C标准管×ΔA测定÷ΔA标准×V总÷(Cpr×V样)÷T×F =9 ×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr×F
建议使用本公司BCA法蛋白质含量检测试剂盒检测蛋白浓度，货号：PDM005 PDM006。
3、按样本鲜重计算：
单位定义：每小时每克组织中P5CS消耗ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
P5CS活力(μmol/h /g 鲜重)=C标准管×ΔA测定÷ΔA标准×V总÷(W× V样÷V样总)÷T×F =9 ×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F
C标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V总：酶促反应总体积，0.3mL；V样：酶促反应加入样本体积，0.1mL ；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；F：样本稀释倍数。
注意事项：
1. 标准磷的线性范围为0.078-2.5μmol/mL，ΔA的线性范围为0.08-2.554。
2. 按照说明书推荐的顺序，依次加入试剂。
3. 当ΔA测定＞1.5时，说明样本中P5CS活性较高，建议适当稀释样本后重新测定，并将稀释倍数(F)代入计算公式；当ΔA测定＜0.10时，说明样本中P5CS活性较低，建议适当增加样本加样量或减少稀释倍数后重新测定。
4. 空白管和标准管只要做一管。每个测定管设一个对照管。
5. 仅供研究使用。不得用于诊断程序。
实验实例：
样本检测：
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样本 |
质量 |
稀释倍数 |
A测定 |
A对照 |
ΔA测定 |
ΔA标准 |
计算结果 |
|
牛肝 |
0.1258g |
2 |
1.46 |
1.155 |
0.305 |
0.484 |
90.17μmol/h /g 鲜重 |
常见问题及解决方案：
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问题 |
可能原因 |
解决方法 |
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样品读数重复性差 |
样品类型不合适 |
参考说明书了解不兼容的样品类型 |
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组织样品匀浆不充分 |
延长超声时间/增加匀浆器的研磨次数 |
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样品反复冻融次数过多 |
将样品分装，不可反复冻融 |
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样品中含有干扰物质 |
排查干扰物质，必要时对样品进行脱蛋白处理 |
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样品读数超出线性范围 |
对样品进行浓缩或稀释，使读数处于线性范围内 |
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孔中有气泡 |
气泡会干扰读数，操作时尽量避免产生气泡，读数前务必去除气泡 |
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样品和标准品读数偏低/偏高 |
样品放置时间过长或储存不当 |
使用新鲜制备的样品，按推荐温度保存至使用前 |
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试剂盒组分未完全解冻 |
待组分完全解冻后轻轻混匀再使用 |
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试剂在冰上放置时间过长 |
每次使用前新鲜配制反应混合液 |
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孵育时间/温度不当 |
参考说明书推荐的孵育时间和/或温度 |
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试剂加样量错误 |
检查移液枪是否校准(始终使用能吸取整体积的最小量程移液枪)；尽量避免吸取过小体积的试剂 |
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|
配制反应混合液时移液误差 |
始终配制混合母液 |
参考文献：
[1] Kyaw A, Maung-U K, Toe T. Determination of inorganic phosphate with molybdate and Triton X-100 without reduction. Anal Biochem. 1985 Mar;145(2):230-4. doi: 10.1016/0003-2697(85)90354-9. PMID: 4014655.
| 象形图 | |
|---|---|
| 警示语 | |
| Class | |
| 警告声明 | |
| UNub | |
| 危险声明 | |
| Packing Group |
| AC031吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性检测试剂盒说明书-钼酸铵比色法（分光光度法50T24S）-V2.2.docx | 下载 |
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