0518-81263339
木质素过氧化物酶（Lip）活性检测试剂盒说明书-藜芦酸法
分光光度法50管/48样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，属于木质素降解酶系，在木质素生物降解、造纸工业、纺织工业、芳香化合物转化与降解及环境污染控制等方面具有较大的应用潜力。测定原理：
木质素过氧化物酶氧化藜芦醇生成藜芦醛，在310nm处有特征吸收峰。试剂组成和配制：
|
产品名称 |
OT039-50T/48S |
Storage |
|
试剂一：液体 |
100mL |
4℃ |
|
试剂二：液体 |
400μL |
4℃避光 |
|
试剂三：液体 |
20μL |
4℃避光 |
|
说明书 |
一份 |
|
试剂二：临用前取75μL试剂二，加入2.425mL蒸馏水混匀；用多少配多少，现用现配，试剂当天用完。
试剂三：临用前取8μL试剂三，加入5mL蒸馏水混匀；用多少配多少，现用现配，试剂当天用完。
自备材料:
天平、低温离心机、可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。
样本处理：
1、组织：按照样本质量（g）：试剂一体积（mL）为1:5~10 的比例 （建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆；10000g 4°C离心10min，取上清置冰上待测。
2、细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500-1000:1 的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 试剂一）加入试剂一，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率300W，超声 3s，间隔 7s，总时间3min），10000g 4°C离心10min，取上清置冰上待测。
3、培养液或其他液体：直接检测。若溶液浑浊则离心后取上清进行测定。
测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至310nm处，蒸馏水调零。
2、测定前根据实验用量取出部分试剂一、试剂二、试剂三置于37℃预热10min以上。
|
试剂（μL） |
测定管 |
|
试剂一 |
600 |
|
试剂二 |
200 |
|
样本 |
100 |
|
试剂三 |
100 |
|
将上述试剂加入1mL石英比色皿后迅速吹打混匀，从加完最后一个试剂开始计时，记录第15s的吸光值A1，将混合液置于37℃水浴锅/恒温培养箱培养5min，取出测定5min15s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。注意保证测定时间的准确性 |
|
计算：
|
1.按样本蛋白质浓度计算 酶活定义：37℃，pH4.5条件下，每mg组织蛋白每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。 Lip活性（U/mg prot)=ΔA×V反总÷（ε×d）×109÷(V样×Cpr)÷T=215.05×ΔA÷Cpr 2.按样本质量计算 酶活定义：37℃，pH4.5条件下，每g组织每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。 Lip活性 （U/g 质量）=ΔA×V反总÷（ε×d）×109÷(V样÷V样总×W)÷T =215.05×ΔA÷W 3.按细菌/细胞数量计算 酶活定义：37℃，pH4.5条件下，每104细菌/细胞每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。 Lip活性（U/10⁴ cell)=ΔA×V反总÷（ε×d）×109÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T=215.05×ΔA÷细胞数量 4、 按照样本体积计算 酶活定义:37℃，pH4.5条件下，每mL血清或液体样本每分钟氧化1nmol藜芦醇所需酶量为一个酶活单位。 Lip活性 （U/mL）=ΔA×V反总÷（ε×d）×109÷V样÷T=215.05×ΔA ε：藜芦醛摩尔消光系数：9300L/mol/cm；d：1mL石英比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.001L；V样：加入样本体积，0.1mL，V样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min；109：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；细胞数量：500万，以万计。 |
注意事项：
1. 试剂二和试剂三现用现稀释，不可放置超过24h。
2. 本法中△A最低警戒线为0.005；若小于0.005，可适当增加样本浓度。
常见问题及解决方案：
|
问题 |
可能原因 |
解决方法 |
|
样品读数重复性差 |
样品类型不合适 |
参考说明书了解不兼容的样品类型 |
|
组织样品匀浆不充分 |
延长超声时间/增加匀浆器的研磨次数 |
|
|
样品反复冻融次数过多 |
将样品分装，不可反复冻融 |
|
|
样品中含有干扰物质 |
排查干扰物质，必要时对样品进行脱蛋白处理 |
|
|
样品读数超出线性范围 |
对样品进行浓缩或稀释，使读数处于线性范围内 |
|
|
孔中有气泡 |
气泡会干扰读数，操作时尽量避免产生气泡，读数前务必去除气泡 |
|
|
样品和标准品读数偏低/偏高 |
样品放置时间过长或储存不当 |
使用新鲜制备的样品，按推荐温度保存至使用前 |
|
试剂盒组分未完全解冻 |
待组分完全解冻后轻轻混匀再使用 |
|
|
试剂在冰上放置时间过长 |
每次使用前新鲜配制反应混合液 |
|
|
孵育时间/温度不当 |
参考说明书推荐的孵育时间和/或温度 |
|
|
试剂加样量错误 |
检查移液枪是否校准（始终使用能吸取整体积的最小量程移液枪）；尽量避免吸取过小体积的试剂 |
|
|
配制反应混合液时移液误差 |
始终配制混合母液 |
| 象形图 | |
|---|---|
| 警示语 | |
| Class | |
| 警告声明 | |
| UNub | |
| 危险声明 | |
| Packing Group |
| OT039木质素过氧化物酶（Lip）活性检测试剂盒（分光光度法50T48S）-藜芦酸法V2.1.docx | 下载 |
扫码关注