0518-81263339
酪氨酸酶(TYR)活性检测试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，TYR，Tyrosinase)是1种结构复杂的含多亚基的含铜氧化还原酶，具有双功能的含铜糖蛋白，广泛存在于微生物、动植物和人体中，参与黑色素的生物合成。酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶，也是引起果蔬酶促褐变的主要因素，同时也对昆虫的免疫及生长有重要影响。
测定原理：
L-酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴，多巴经酪氨酸酶催化生成多巴醌，多巴醌与MBTH生成紫红色物质，在505nm处有特征吸收峰，据此可以计算酪氨酸酶的活性。
试剂组成和配制：
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产品名称 |
AO050-100T/96S |
Storage |
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提取液：液体 |
110mL |
4℃ |
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试剂一：液体 |
30mL |
4℃ |
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试剂二：粉剂 |
3瓶 |
4℃避光 |
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试剂三：液体 |
5mL |
4℃ |
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试剂四：粉剂 |
1瓶 |
4℃避光 |
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说明书 |
一份 |
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提取液、试剂一：若有试剂析出，可37℃复溶。
试剂二：临用前每瓶加入7mL试剂一充分溶解待用，现配现用。溶解后易氧化，24h内要尽快用完。试剂二较难溶解，可37℃水浴或超声助溶，确保溶解完全。
试剂四：临用前加入1.65mL蒸馏水溶解待用，该试剂为饱和溶液，若有析出可置于45℃水浴锅加热溶解；用不完的试剂放4℃避光保存8周。
需自备仪器和用品：
酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰、蒸馏水。
样本处理：
1、 组织样本：按照质量(g)：提取液体积(mL)为1： 5~10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液)加入提取液，进行冰浴匀浆。12000g，4℃，离心10min，取上清，置于冰上待测。
2、 细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃去上清；按照细菌或细胞数量(106个)：提取液体积(mL)为5~10：1的比例(建议500万个细菌或细胞加入1mL提取液)，超声破碎细菌或细胞(冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次)；8000g，4℃离心10min，取上清，置于冰上待测。
测定步骤：
1、酶标仪预热30min以上，波长调至505nm。
2、实验前，根据样本数量取部分试剂二37℃预热5min。
4、在96孔板/EP管内按序依次加入下列试剂：
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试剂名称(μL) |
测定管 |
空白管 |
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试剂二 |
200 |
200 |
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试剂三 |
40 |
40 |
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样本 |
27 |
- |
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蒸馏水 |
- |
27 |
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充分混匀，37℃准确反应30min |
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试剂四 |
13 |
13 |
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充分混匀，于12000g，4℃离心5min，取上清液200μL于96孔板中，测定505nm处的吸光度，分别记为A测定、A空白。计算ΔA测定=A测定-A空白。空白管只需测1-2次即可。 |
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酪氨酸酶酶活计算公式：
1、 按蛋白浓度计算：
单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟使505nm下的吸光值变化0.005定义为一个酶活单位。
酪氨酸酶活性(U/mg prot)=ΔA测定×V反总÷(V样×Cpr)÷0.005÷T×F=69.14×ΔA测定÷Cpr×F
建议使用本公司BCA法蛋白质含量测定试剂盒，货号：PDM005 PDM006。
2、 按样本质量计算：
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟使505nm下的吸光值变化0.005定义为一个酶活单位。
酪氨酸酶活性(U/g 质量)=ΔA测定×V反总÷(V样÷V提取×W)÷0.005÷T×F=69.14×ΔA测定÷W×F
3、 按细胞/细菌数量计算：
单位定义：每106个细胞或细菌在反应体系中每分钟使505nm下的吸光值变化0.005定义为一个酶活单位。
酪氨酸酶活性(U/106 cell)= ΔA测定×V反总÷(N×V样÷V提取)÷0.005÷T×F=69.14×ΔA测定÷N×F
V反总：反应总体积，280μL=0.28mL；V样：加入的样本体积，27μL=0.027mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V提取：提取液体积，1mL；N：细胞或细菌总数，以百万计；T：反应时间，30min；F：样本稀释倍数。
注意事项：
1. 当样本ΔA大于1.5时，建议将样本用蒸馏水稀释后测定。计算时注意同步修改计算公式。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
实验实例：
样本检测：
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样本 |
质量 |
稀释倍数 |
A测定 |
A空白 |
ΔA测定 |
酪氨酸酶活性 |
|
牛肝 |
0.18g |
1 |
0.143 |
0.051 |
0.092 |
35.34 U/g 质量 |
|
白玉菇 |
0.338g |
4 |
0.39 |
0.051 |
0.339 |
277.38 U/g 质量 |
常见问题及解决方案：
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问题 |
可能原因 |
解决方法 |
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样品读数重复性差 |
样品类型不合适 |
参考说明书了解不兼容的样品类型 |
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组织样品匀浆不充分 |
延长超声时间/增加匀浆器的研磨次数 |
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样品反复冻融次数过多 |
将样品分装，不可反复冻融 |
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样品中含有干扰物质 |
排查干扰物质，必要时对样品进行脱蛋白处理 |
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样品读数超出线性范围 |
对样品进行浓缩或稀释，使读数处于线性范围内 |
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孔中有气泡 |
气泡会干扰读数，操作时尽量避免产生气泡，读数前务必去除气泡 |
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样品和标准品读数偏低/偏高 |
样品放置时间过长或储存不当 |
使用新鲜制备的样品，按推荐温度保存至使用前 |
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试剂盒组分未完全解冻 |
待组分完全解冻后轻轻混匀再使用 |
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试剂在冰上放置时间过长 |
每次使用前新鲜配制反应混合液 |
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孵育时间/温度不当 |
参考说明书推荐的孵育时间和/或温度 |
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试剂加样量错误 |
检查移液枪是否校准(始终使用能吸取整体积的最小量程移液枪)；尽量避免吸取过小体积的试剂 |
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配制反应混合液时移液误差 |
始终配制混合母液 |
参考文献：
[1] Kim, Dae Wook et al. "Phenols displaying tyrosinase inhibition from Humulus lupulus." Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry vol. 31,5 (2016): 742-7. doi:10.3109/14756366.2015.1063621
| 象形图 | |
|---|---|
| 警示语 | |
| Class | |
| 警告声明 | |
| UNub | |
| 危险声明 | |
| Packing Group |
| AO050 酪氨酸酶_TYR_活性检测试剂盒说明书-_微量法100T96S_V2.0.docx | 下载 |
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